基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个靶标。其探针采用双标记、自淬灭的TaqMan探针或分子信标，检测原理为：当TaqMan探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，因荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)使得荧光信号较弱。而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。